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生化分析儀器一般工作流程

生化分析儀的正確應用,只是掌握了測定技術原理還不夠,還需要對具體儀器的工作流程及測定計算方法有足夠的了解。   

(一)一般工作流程

工作流程可以通過儀器的測定周期來考察。重點關注比色杯空白讀數點(CB)、加樣品點(S)、各試劑加液點(R1、R2、……)、試劑空白讀數點(RB)、各測定讀數點(P)、各點時間間隔及周期總時間等。每個儀器一般都在反應轉盤的固定位置和反應測定周期的固定時間設置樣品試劑和稀釋的加液位,以及測定讀數點。如HITACHI 7170在P1到P34周期為10分鐘時,PO前加樣品,Rl在Pl前,R2在P5和P6間,R3在P16和P17間,R4在:P33和P34間。

(二)數據處理計算方法

儀器在各個吸光度讀數點讀取的吸光度數據,并不一定都納人濃度計算。儀器往往根據儀器定義和操作者設定的要求,對吸光度原始數據作計算處理,轉換成所謂反應數據,再按系數或公式作濃度計算。舉例如下:

1.HITACH 7170的終點法測定點(A )吸光度計算為(AX+AX-1)/2。實際吸光度=吸光度數據×10 000。

2.0LYHPUS AU 600試劑空白數據:P0點試劑空白(RB)=P0點吸光度一比色杯水空白(wB);任一測定點試劑空白(RB )。該點吸光度一比色杯水空白(WB)。

3.Monarch 1 000兩點終點法的反應數據。(終點測定吸光度一終點空白吸光度)一(始點測定吸光度一始點空白吸光度)。

4.AU 600的終點法(帶試劑空白,END法)的反應數據=終點吸光度一P0點吸光度(試劑空白,RB)。終點法(不帶試劑空白,END).法)的反應數據=終點吸光度-比色杯水空白(WB)。

5.Au 600的兩點法(自身空白)的反應數據=[加第二試劑后測定點讀數一P0點讀數]一[加第二試劑前測定點讀數一PO點讀數]。

三、主要操作程序

(一)儀器運行前操作程序

主要進行儀器的基本設置:

l.試驗項目設置對試驗名稱、編碼,試驗組合(Profile)、試驗輪次(Round),必要時包括試驗順序等設置。  

2.各試驗的參數設置包括試驗間比值、結果核對等參數的設定。

3.劑設置根據有關試驗參數,設置各試驗的試劑位、試劑瓶規格,必要時設定試劑批號、失效期等。

4.校準品設置對校準品的位置、濃度和數量等進行設置。

5.質控設置 根據質控要求。設置質控物個數,質控規則,質控項目及相應質控參數等。

6.樣品管設置 包括樣品管類型,殘留液高度(死體積),識別方式等設置。

7.其他設置對數據傳輸方式、結果報告格式、復查方式及復查標準等設置。

(二)常規操作程序

開機(預熱、保養)-設置開始條件(日期時間索引、輪次、樣品起始號等)-根據需要,申請校準、質控和病人測定項目(包括架號、杯號或順序號。測定中可繼續申請)_裝載校準品、質控物和病人標本-裝載試劑-核對儀器起始狀態(未應用條碼系統,采用順序識別樣品時,尤其要核對測定起始編號是否與樣品架號和申請號相符)-定標和質控測定-檢查定標和質控結果-病人標本測定-測定過程監控(試劑檢查,觀察分析結果,編輯校正)-數據傳遞(打印報告,向檢驗管理系統傳輸,包括工作量統計、財務統計、病人情況追蹤、質控分析等)。測定后保養。

(三)測定結果檢查分析

1.要了解和熟悉儀器的各種警示符號的含義與作用在正確設定參數的前提下,利用各種警示符能提高我們發現問題和解決問題的效率。

2.要熟悉和靈活運用儀器的相關操作屏(界面) 如:用反應過程監測(Reaction Monitor),觀察反應時間進程曲線;用校準追蹤(Calibration Trace)回顧分析校準曲線;利用統計(Statistics)了解不同日期段病人測定均值及數據分析;運用分析數據編輯(Data Edit)察看和校正測定數據。

3.校準的檢查要充分利用儀器設置的功能,監測校準曲線圖形、各校準點吸光度值(不能忽略試劑空白值及空白速率值)、計算K值等的波動情況,以及與以往的比較。必要時,應進一步檢查反應時間進程曲線。必須結合質控數據來把握實驗條件。

4.病人結果的檢查除了目測觀察或用血清指數了解標本性狀,注意和了解臨床資料及診斷外,學會分析反應時間進程曲線及數據是重要的基本功。

四、基本測定方法   

(一)終點法(End point method)   

根據反應達到平衡時反應產物的吸收光譜特征及其吸光度大小,對物質進行定量分析的方法。對一般化學反應來說,反應完全(或正、逆反應動態平衡)、反應產物穩定時為反應終點。對抗原一抗體反應來說,是抗原和抗體完全反應、形成最大且穩定的免疫復合物時為終點。在反應時間進程曲線上為與x軸平行線區段。在測定計算方式上,一般分為一點法和兩點法兩種。

1.一點法(One Point) 以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB)、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測定計算基點,以反應終點的吸光度讀數減去空白讀數,得到反應吸光度。通過與相同條件下校準液反應吸光度的比較,求得測定結果。常與一點校準法配合使用,即采用一個校準濃度,校準曲線通過零點且成線性。也應用多點校準。

2.兩點終點法(Two Point End)即終點一始點法 以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點,以反應終點的吸光度讀數減去始點讀數。一定條件下可降低樣品對反應或反應本身的特異性于擾(主要指色度干擾)。常采用雙試劑,多以加R2前某一點作測定始點;某些情況下,也可以加R2后一點作測定始點。若使用單試劑,主反應啟動太快或儀器起始讀數點受限時難以運用。

固定時間法(Fixed Method)與兩點終點法的區別只是在:測定讀數的末點不在反應平衡區段,而是根據方法學選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測定。

3.三點終點法 即雙終點法,在一個通道內一次進行兩項反應相關的終點法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器(如HITACHI系列)設置此方法。

(二)連續監測法(Continuous monitoring method)

又稱速率法(Rate Assay)。即連續監測反應過程,根據所測定的產物生成或底物消耗的速度進行定量分析的方法。在反應時間進程曲線上為反應呈恒速區段(斜率保持不變),常用于酶活性線性反應期測定。

1.連續監測法即零級反應速率法,亦稱斜率法。在較長的反應時間區段內(至少90-120秒),每隔一定時間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值,至少讀取4點,得到3個△A;一般將連續多次讀數作最小二乘法處理,讀數間隔時間太短的作帶速率時間(TR)多點法處理,均取線性反應部分的讀數,求出單位時間內的反應速率△A/min。此法必須以零級反應為測定計算的基礎,因為只有在零級反應下,單位時間內的吸光度變化(反應速率△A/min)才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差,大大提高了分析速度和準確性。但是,半自動生化分析儀采用單樣品連續監測,相當耗時。應用連續監測法,首先應準備線性范圍內的高、中、低濃度的樣品,分別作反應時間進程曲線,了解不同濃度下反應全過程,兼顧確定延遲時間和線性監測期。

2.兩點速率法即所謂擬一級速率法。在反應中選取兩時問點t 1、t 2,讀取吸光度A 1、A2,計算(A2-A1),(t2-t1)=△A,△t。此方法與終點兩點法的區別主要有兩點:后一讀數點反應未達終點,以速率計算結果。它與連續監測法比較,缺點在于人為確定t 1、t 2,不定因素較多,不能保證反應在t 1-t 2期間呈線性,影響結果準確性;應在常規測定前,先做預試驗來確定線性時間段。若在選擇的時間段內反應不成線性(如零級反應期短,儀器無法設置或測定),則只能改用終點法。優點在于方法簡單;酶活力較低、測定吸光度值較小時,可增加測定時間段而不受儀器連續監測時間點的局限,減少讀數誤差。

3.速率B法在一個通道內一次進行兩項反應相關的速率法測定。它既可以是兩項試驗測定,也可用于干擾或/及樣品空白自動補償0后一用途的原理是:利用儀器的微機自動處理,在第一反應(干擾反應)一直維持線性的前提下,可以從第二反應(主反應)速率中扣除第一反應速率的延續影響。如用于消除膽紅素轉化為膽綠素吸光度下降、對肌酐苦味酸法測定的負干擾等。某些儀器(如HITACHI系列)設置此方法。

(三)空白(blank)校正

在分光光度法中,常利用空白溶液來調節儀器的吸光度零點,或用來抵消某些測定的干擾因素。在生化分析儀測定中,除了采用雙或多波長、兩點法等排除背景干擾外,常要運用專門空白測定,以便從樣品測定吸光度中扣除其影響。正確選擇空白校正,對提高準確度起重要作用。

1.試劑空白一般在方法類型和校準模式中,即分為有或無試劑空白兩大類。試劑空白單獨測定或與校準配合測定,并需預選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。校準或病人樣品的各測定點吸光度,均要扣除相應測定點的試劑空白吸光度或空白速率值。無試劑空白的方法,多直接以反應杯的水空白作為測定基準值。

在不少儀器中,試劑空白測定類似校準測定,并非在病人樣品測定時實時測定。所以,要注意它的測定頻率,避免因試劑批號或質量的變化造成試劑空白的改變引起的計算誤差。

2.樣品空白 主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法,測定校正結果=顯色反應通道結果-空白通道結果。多數儀器須另外占用測定通道,分析速度減半,但去干擾的準確性應高于兩點終點

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